ToF(time-of-flight) 질량 분광분석기(mass spectrometry, MS)가 다양한 영역에서 중요한 장비로 자리잡고 있으며, 특히 임상 미생물 검사실에서 박테리아 검사에 없어서는 안될 역할을 한다. ToF MS에서 핵심적인 부품이 저잡음 고속 아날로그-디지털 컨버터(ADC)이다. 이 글에서는 ToF MS의 작동 원리와 주요 파라미터에 대해서 알아본다. 또한 ToF MS 파라미터와 ADC 사양 사이의 관계를 알아본다. 아나로그디바이스(ADI)의 MxFE^®(mixed-signal front-end) ADC는 저잡음 고속 ADC가 ToF MS에서 질량 정확도, 질량 분해능, 감도 같은 주요 파라미터를 얼마나 크게 향상하는지 보여준다.


ToF MS의 작동 원리

질량 분광분석법은 주어진 샘플로 분자 무게에 근거해서 알려지거나 알려지지 않은 분자들을 수치화하는 분석 기법이다. 샘플의 원소와 분자를 단편화(fragmentation) 유무에 관계없이 기체 이온으로 이온화한 다음 이들을 질량 분석기(mass analyzer)에서 분리함으로써, 원소와 분자를 질량 대 전하비(m/z) 또는 펄스의 위치, 질량 스펙트럼에서 상대 풍부도(relative abundance) 또는 펄스의 진폭을 가지고 분석한다.

질량 분광분석기는 크게 세 부분으로 이루어진다. 이온 소스는 테스트하려는 샘플로부터 기체 이온을 발생하고, 질량 분석기는 이온들을 각자의 m/z 비율에 따라 분리하고, 이온 검출기는 이온을 검출하여 각 이온 종류의 상대 풍부도를 구한다. 이 검출기 출력을 컨디셔닝하고 디지털화해서 질량 스펙트럼을 생성한다. m/z 값이 서로 다른 이온들을 분리하기 위해 다양한 기법들을 사용하는 여러 질량 분석기들이 제공되고 있다¹. 그림 1은 쿼드러플 및 ToF MS의 주요 블록들을 보여준다.

 


ToF MS 안을 들여다보면, 짧은 이온화 이벤트로 생성된 이온들을 정전기장으로 가속화해서 m/z가 서로 다른 이온들이 운동 에너지는 같지만 속도는 다르게 한다. 그러면 이온들이 전기장이 없는 드리프트 경로를 통해 이동해서 서로 다른 비행 시간으로 검출기에 도착한다. 더 가벼운 이온이 무거운 이온보다 먼저 도착한다(그림 2). 실제로는 초기의 공간 분포와 가속 영역에서의 에너지(또는 속도) 차이 때문에, 동일한 m/z의 이온들의 비행 시간이 수백 피코초(ps)만큼 좁게 분포하여 펄스를 형성한다. 각각의 펄스는 여러 개별 이온 도착 이벤트에 해당하는 신호들의 합으로서, 흔히 반치전폭(full width at half-maximum, FWHM) 파라미터를 이용해 특성을 분석한다.

그 다음에는 마이크로채널 플레이트(microchannel plate, MCP) 검출기 같은 검출기가 들어오는 이온들을 검출하고 전기 전류 펄스를 발생한다. 이 전기 전류를 시간-대-디지털 컨버터(TDC)나 고속 ADC를 사용해서 기록한다. TDC는 수 피코초에 이를 정도로 극히 빠를 수 있으나 펄스 진폭을 기록하기에는 제한된 동적 범위를 가지고 있다. 고속 ADC는 10비트, 12비트, 혹은 그 이상의 분해능으로 초당 2기가샘플(GSPS) 이상의 성능을 달성할 수 있어 펄스의 타이밍과 진폭을 모두 정확하게 기록할 수 있다. ToF MS의 성능에 영향을 미치는 고속 ADC의 주요 사양들에 대해서는 뒤에서 좀더 자세히 설명한다.

ToF MS의 애플리케이션

ToF MS는 1990년대에 매트릭스 보조 레이저 탈착 및 이온화(matrix-assisted laser desorption and ionization, MALDI) 기술이 개발 및 상용화되면서 관심을 받기 시작했다². MALDI 기술은 매트릭스 분자(통상적으로 유기산)를 이온화하고, 동시에 수백 피코초에서 수 나노초에 이르는 자외선(UV) 레이저 펄스를 사용해서 샘플 분자들을 기화한다. 기체 상태에서 매트릭스 분자가 양자들을 샘플 분자들로 전이함으로써 샘플 분자들이 양자화되고 전하를 띤 이온이 된다.

매트릭스가 대부분의 레이저 에너지를 흡수하기 때문에 샘플 내의 분자들은 단편화나 분해를 하지 않아도 자신의 무결성을 유지하므로, MALDI는 생물학적 고분자 분석을 위한 가장 경쟁력 있는 이온화 기법으로 자리잡았다. 이러한 MALDI와 ToF MS를 손쉽게 결합할 수 있고 무한정한 질량 범위, 높은 감도, 높은 쓰루풋이 가능하다는 점에서 ToF MS는 생의학 연구, 약물 발견, 고분자 분석을 필요로 하는 임상 애플리케이션에서 필수 장비가 되고 있다.

특히 MALDI ToF MS는 4시간의 극히 빠른 턴어라운드 시간 때문에 임상 박테리아 검사에서 대체할 수 없는 중요한 역할을 한다. 이에 비해 기존 기술이나 그 밖에 다른 최신 기술들은 턴어라운드 시간이 72시간이 넘는다³. 짧은 턴어라운드 시간은 박테리아 감염으로 고생하는 환자들의 효과적인 치료를 위해서 중요하다. MALDI ToF MS의 또 다른 장점은 샘플 준비가 손쉽고, 운용 비용이 적게 들며, 희귀 박테리아를 식별할 수 있다는 것이다. 항균 내성이 전세계적으로 인류 건강에 주요한 위협이 되고 있는 가운데, MALDI ToF MS를 현장 진료(point-of-care) 장비로 사용하는 추세가 늘고 있다⁴.

ToF MS의 주요 파라미터

ToF MS가 테스트 샘플에서 서로 다른 피분석물을 수치화하는 능력은 샘플 이온화 기법, 구성, 이온들을 가속화하고 이온 검출기 쪽으로 유도하기 위한 전기장의 타이밍 특성, 검출기 효율, 신호 디지털화 같은 다양한 요소들에 의해 좌우된다. 이처럼 다양한 요소들 가운데, 이 글에서는 신호 디지털화와 관련된 ToF MS의 주요 사양들에 대해서 살펴볼 것이다. 이러한 사양들로는 질량 범위, 질량 정확도, 질량 분해능, 반복률, 감도를 들 수 있다.

질량 범위는 샘플 내의 분자들의 무게 범위로서, 가속화 전압, 플라이트 튜브 길이, 샘플링 속도, 반복률 같은 요소들과 관련된다. 질량 범위 요구는 애플리케이션마다 다를 수 있다. 일례로 MALDI ToF MS를 사용한 박테리아 검사는 2,000 Da부터 20,000 Da까지의 질량 범위에서 리보솜 마커를 측정한다.

질량을 비행 시간으로 계산하기 때문에, ToF MS의 질량 정확도는 펄스의 시간 측정 정확도에 의해 크게 좌우된다. 실제로는 펄스를 가우스 함수로 피팅하고 피크를 구하는 방법으로 펄스의 도착 시간을 계산한다. ADC 샘플링 속도가 개별 펄스에 대한 샘플 수를 결정하므로 펄스 피팅을 위해서 중요하다.

질량 분해능은 스펙트럼에서 인접한 두 펄스 사이에 구분이 가능하면서 가장 가까운 거리를 나타낸다. 흔히 질량 분해능은 이온 질량 대 해당 질량 펄스 폭의 비율로 정의된다. 여기서 말하는 펄스 폭은 통상적으로 FWHM이다. 펄스 폭이 좁을수록 질량 분해능은 더 높다. 그러므로 분자 무게가 비슷한 두 이온 집단을 더 잘 구분할 수 있다. 직교 가속화와 반사를 사용해서 질량 분해능을 크게 향상할 수 있다. ADC 샘플링 속도와 잡음 성능이 이 사양에 영향을 미친다.

ToF MS에서 질량 스펙트럼은 한 번의 이온화, 가속화 및 드리프팅, 이온 검출 및 디지털화만을 포함하는 단일 트랜션트가 아니라 이 프로세스를 여러 번 반복한 것의 신호들을 합친 것이다. 무게와 농도가 서로 다른 여러 분자들을 포함하는 테스트 샘플일 경우에, 단일 이온화 이벤트로는 해당하는 모든 분자들의 이온을 발생하지 못할 수 있고, 또한 농도에 비례하는 비율로 발생하지 못할 수도 있다.

합산(summation)은 이러한 샘플링 오차를 낮추고 신호대 잡음비(SNR)를 향상할 수 있는 효율적이고도 실용적인 방법이다. 그러므로 반복률(repetition rate)은 ToF MS에서 SNR과 쓰루풋을 위해 실질적으로 중요한 사양이다. 최신 ToF MS는 1kHz 혹은 그보다 빠른 스캔을 달성할 수 있는데, 이는 각 트랜션트에 1밀리초 혹은 그 이하가 걸린다는 것을 뜻한다. ADC 샘플링 속도를 높이면 매 트랜션트의 지속시간을 단축하고 더 빠른 반복률을 달성할 수 있다.

ToF MS의 감도는 샘플에서 얼마나 낮은 농도로 분자를 검출할 수 있는지를 나타낸다. 이 사양은 화학적 배경 잡음, 모든 해당 분자들의 농도 범위, 검출기와 ADC의 잡음 지수와 동적 범위, 최종적인 질량 스펙트럼에 대해 합한 트랜션트 수 같은 여러 요소들에 의해 결정된다. 병목 요인들을 찾아내고 이러한 요인들을 적절하게 절충해서 시스템 감도를 최적화할 수 있다.

ToF MS 용으로 요구되는 ADC 사양 

저잡음 고속 ADC는 ToF MS의 시스템 성능에서 중요한 역할을 한다. 앞서 언급했듯이, ToF MS 장비의 두 가지 중요한 사양은 시간 측정 정확도와 시스템 잡음 수준이다. 시스템 잡음은 반복적 측정을 합치는 방법으로 해결할 수 있는 반면에, 시간 측정 정확도는 고속 ADC의 샘플링 속도와 애퍼처 지터에 따라서 결정된다. ToF MS 장비로 직교 가속화와 반사를 사용했을 때 펄스 폭이 수백 ps에 이를 만큼 좁을 수 있기 때문에, 5GSPS 샘플링 속도라고 했을 때 개별 펄스로 몇 개의 샘플밖에 되지 않는다. 그러므로 이 샘플들을 가우스 함수로 피팅해서 피크를 구하기 위해서는 모든 샘플이 중요하다. 그러므로 샘플링 속도와 애퍼처 지터(aperture jitter)가 중요하게 요구된다.

감도는 시스템 잡음 수준에 따라서 좌우되고, 시스템 잡음은 반복적 측정을 합치는 방법으로 향상할 수 있다. 하지만 여러 번의 반복은 장비의 쓰루풋을 제한한다. 그러므로 더 적은 반복으로 목표 감도를 달성하기 위해서는 ADC의 잡음 성능이 중요하다. ADC 성능과 관련해서 흔히 잘못 알고 있는 것이, ADC의 SNR이 비트 분해능에 비례한다는 것이다. 샘플링 속도가 1GSPS 혹은 그 이상인 ADC는 대체로 파이프라인형 아키텍처이고 유효 비트 수(effective number of bit, ENOB)와 잡음 밀도/잡음 지수/SNR 같은 사양들을 사용한다. 그런데 파이프라인형 ADC는 잡음을 늘릴 수 있는 여러 가지 약점들 때문에 비트 분해능을 달성하지 못한다.

이러한 약점들로는 오차를 줄이기 위해 요구되는 높은 이득과 넓은 대역폭의 연산 증폭기, 커패시터 불일치, 프런트엔드 샘플-앤-홀드(S/H) 및 연산 증폭기의 전력 소모를 들 수 있다⁵. ENOB는 입력 주파수와 샘플링 속도에 따라 달라지며, 신호대 잡음 및 왜곡 비(SNDR)를 사용해서 계산할 수 있다. 예를 들어 12비트 AD9081은 4GSPS, 4500MHz 입력 주파수일 때 ENOB가 8비트이다. ENOB는 ADC의 잡음 성능을 나타내는 척도라고 하기 어렵다. 잡음 밀도가 실제 잡음 수준에 좀더 가까울 수 있으며, ADC의 잡음 성능을(그러므로 ToF MS 장비의 감도를) 정확하게 말해 줄 수 있는 것은 가우스 펄스를 사용한 벤치 테스트이다. 

저잡음 고속 ADC의 벤치 테스트

MxFE는 RF ADC, 디지털-아날로그 컨버터(DAC), 온칩 디지털 신호 프로세싱(DSP), 다중칩 동기화를 위한 클럭/위상 동기 루프(PLL)를 지능적으로 통합하고 있다. 고속 ADC만을 포함하는 MxFE 제품도 있다. 이 글에서 설명하는 벤치 테스트에는 AD9082를 사용했는데, 그림 3에서 보듯이 AD9082는 ADC와 DAC를 모두 포함한다. 이 DAC를 사용해서 0.5ns의 FWHM으로 좁은 폭의 가우스 펄스 트레인을 발생하고 디지털 스케일링과 외부 감쇠기를 사용해서 진폭을 제어했다.

이 가우스 펄스는 ADC 특성 분석 시의 통상적인 단일 톤 신호보다는 질량 스펙트럼의 신호에 훨씬 가깝다. 2개의 ADC 채널을 설정해서 신호를 디지털화했다. CH1은 서로 다른 외부 감쇠기를 사용해서 다양한 진폭으로 포화 또는 감쇠시켰고, CH2는 레퍼런스로서 포화를 하지 않고 90% 풀스케일(FS) 이상의 신호 강도가 되도록 했다. 샘플링 속도는 6GSPS로서, 매 펄스마다 충분한 샘플을 이용할 수 있도록 했다.
 

테스트는 다음과 같이 세 가지를 실시했다:

- 감쇠 및 포화 테스트: CH2는 레퍼런스로서 고정적 7dB 감쇠기 쌍을 연결하고, CH1은 감쇠 사례로는 8dB, 9dB, 10dB 감쇠기 쌍을 연결하고, 포화 사례로는 3dB 및 1dB 감쇠기 쌍을 연결했다.
- 최대 20dB 감쇠를 사용해서 약한 신호 측정: CH2는 레퍼런스로서 -16 dBFSC 스케일링을 사용해서 DAC 출력에 직접 연결하고, CH1은 32% 이하의 FS 신호를 위해 10dB 감쇠기 쌍에, 10% 이하의 FS를 위해서 20dB 감쇠기 쌍에 연결했다.
- 잡음 측정: CH2는 레퍼런스로서 고정적 7dB 감쇠기 쌍을 연결하고, CH1은 50Ω 종단에 연결했다.

각각의 테스트로 10μs 이상의 데이터를 포착하고 재현성(reproducibility) 확인을 위해 데이터 포착을 10회 반복했다. 그리고 이 데이터를 MATLAB에서 플롯으로 그리고 분석했다. 각각의 테스트 사례에 대해 플롯으로 10회의 반복을 정렬했다. 그림 4는 CH1이 CH2보다 3dB 낮은 테스트에서의 단일 펄스를 보여준다. 두 채널에 10회의 반복 결과를 중첩함으로써, 포착된 데이터의 재현성이 높다는 것을 알 수 있다.




AD9082 ADC는 과부하 보호 회로를 포함하기 때문에, 입력 진폭이 상한 한계보다 높으면 이 회로가 작동된다. 이 보호 회로가 작동하면 펄스의 하강 국면에 회복을 위한 꼬리가 형성된다.

그러면 FS와 이 꼬리에서 피크가 잘린다. ToF MS로 정확한 시간 및 질량 측정을 위해서는 회복을 위한 이 꼬리를 짧게 하는 것이 중요하다. 그림 5는 포화(최대 6dB) 또는 감쇠를 사용한 다섯 가지 사례의 플롯을 보여준다. 6dB 감쇠의 경우, 회복을 위한 꼬리가 0.4ns 이하이므로, 보호 회로가 작동했을 때 회복을 위해서 폭이 넓어지는 것이 최소한이라는 것을 알 수 있다.

 

약한 입력으로 ADC 성능을 테스트하기 위해, 10dB 및 20dB 감쇠를 사용해서 신호를 포착했다(그림 6). 10% FS에서, 즉 20dB 감쇠에서 신호 트레이스가 깨끗하다는 것을 알 수 있다. 이것은 ADC가 기여하는 잡음이 최소한이라는 뜻이다. 

 

ADC 잡음 플로어 테스트를 위해서는 CH1을 50Ω 종단에 연결하고 CH2는 90% 이상의 FS를 유지했다(그림 7).
 



잡음 데이터를 분석하기 위해서 히스토그램을 그리고 표준 편차를 계산했다(그림 8). 이 사례의 표준 편차는 0.0025로서, FS에서 52dB의 SNR이다.

 

시간 측정 정확도와 잡음 성능을 좀더 알아보기 위해서, 30ns 윈도우의 중앙에서 피크를 이루는 개별 펄스들을 세분화했다. 그런 다음, 매 펄스를 가우스 모델로 피팅해서 FWHM을 측정했다. 30ns 윈도우 중에서 양쪽으로 12ns(총 24ns) 데이터를 잡음 계산을 위한 베이스라인으로 사용했다. 

그림 9는 가우스핏과 세분화한 기준선을 사용하여 단일 펄스를 10% FS로 입력하고 확대한 테스트 사례에서 측정한 전체 데이터 플롯이다. 표 1은 측정된 FWHM과 SNR을 보여준다.

   
모든 테스트 사례들에서 입력을 1dB부터 20dB까지 감쇠하면서 FWHM과 SNR을 측정했다. 표 2는 이 결과를 요약한 것이다. 이 결과를 보면, 다양한 입력 진폭에 걸쳐서 일관된 FWHM 판독 결과를 나타내는 정확한 시간 측정이라는 것을 알 수 있다.
 


맺음말

MALDI ToF MS가 임상 미생물 검사실에서 박테리아 검사를 위한 표준 장비로 자리잡고 개인 맞춤형 의료를 위한 단백질체학(proteomics)에 대한 관심이 높아지면서, 앞으로 의료 분야에서 MALDI ToF MS는 지속적인 성장이 기대된다. ToF MS는 생체의학 및 신약 연구, 식품 안전, 환경 감시 같은 분야에도 사용될 수 있다. 폭넓은 분자 질량 범위에서 분자들을 정확하게 분석할 수 있기 때문이다.

기존 ToF MS 장비에 사용되는 ADC보다 뛰어난 잡음 성능과 3~6배 더 빠른 샘플링 속도를 자랑하는 저잡음 고속 ADC는 차세대 고성능 ToF MS 장비를 위한 필수적인 요소이다. 플라이트 튜브 길이를 줄일 수 있고, 그럼으로써 진공 시스템의 부담을 덜 수 있기 때문에, 높은 샘플링 속도는 성능을 떨어트리지 않으면서 ToF MS 장비의 풋프린트를 줄일 수 있게 해준다. 더 작은 풋프린트는 ToF MS를 사용하는 현장 진료(point-of-care) 애플리케이션이나 그 밖에 다른 다양한 현장 애플리케이션에서 중요하다.

이 글에서 설명한 AD9082의 벤치 테스트에는 약간의 한계점이 따랐다. 낮은 진폭의 입력으로 테스트 사례(예를 들어 1% FS, 즉 40dB 감쇠)를 생성하기 위해서 사용할 수 있는 외부 감쇠기가 제한적이었고, 임피던스 불일치가 데이터에 반사를 일으킬 수 있었으며, 전자기 간섭에 대한 차폐를 하지 않은 개방된 공간이었다는 점 등이 그렇다.

이들 테스트 사례에서 측정된 SNR은 실제 값보다 낮았는데, 이유는 임피던스 불일치로 인해 베이스라인에서 발생한 반사를 잡음 계산에서 제외하지 않았기 때문이다. 사용자가 좀더 집중적인 테스트를 할 수 있도록 ADI는 MxFE 평가 보드와 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 소프트웨어를 제공하고 있다. 사용자는 라이브 데모에서 안내하는 상세한 지시에 따라서 고객 평가 시스템을 설정할 수 있다. 또한 ADI는 MxFE 샘플을 사용한 프로토타입 개발을 손쉽게 할 수 있도록 숙련된 애플리케이션 팀의 지원을 제공한다.

측정된 FWHM과 SNR은 MxFE ADC의 뛰어난 시간 정확도와 잡음 성능을 보여준다. ADI는 최대 10GSPS에 이르는 샘플링 속도로 다양한 구성의 MxFE 제품을 제공하므로 사용자는 더 높은 질량 정확도와 질량 분해능, 더 높은 감도, 더 소형화된 풋프린트로 차세대 ToF MS를 설계할 수 있는 유연성을 누릴 수 있다. 또한 ADI는 매끄러운 시스템 통합과 최적화를 돕기 위해서 MxFE ADC와 함께 전원, 클러킹, 드라이버 제품들도 제공한다.

참고문헌

1 Jurgen H. Gross. Mass Spectrometry: A Textbook, 3rd Edition. Springer, 2017.
2 Eva Torres-Sangiao, Cristina Leal Rodriguez, and Carlos Garcia-Riestra. “Application and Perspectives of MALDI?ToF Mass Spectrometry in Clinical Microbiology Laboratories.” Microorganisms, Vol. 9, 2021.
3 Mohammad Y. Ashfaq, Dana A. Da’na, and Mohammad A. Al-Ghouti. “Application of MALDI-ToF MS for Identification of Environmental Bacteria: A Review.” Journal of Environmental Management, Vol. 305, 2022.
4 E. Chabriere, H. Bass?ne, M. Drancourt, and C. Sokhna. “MALDI-ToF MS and Point of Care Are Disruptive Diagnostic Tools in Africa.” New Microbe and New Infections, Vol. 26, 2018.
5 Chun C. Lee. Dissertation: Improving Accuracy and Energy Efficiency of Pipeline Analog to Digital Converters. The University of Michigan, 2010.


저자 소개

기쉬에 (글렌) 부(Guixue (Glen) Bu)는 아나로그디바이스(Analog Devices) 계측기 시스템 솔루션 그룹의 시스템 설계/아키텍처 엔지니어로서, 과학 장비 애플리케이션을 주로 맡고 있다. 2018년 9월에 ADI에 입사했다. 칭화대학에서 생체의공학 전공으로 학사학위를, 퍼듀 대학에서 석사학위 및 박사학위를 취득했다.